脂质组学联合机器学习筛选老年早期肺癌标志物

肺癌

是全球范围内死亡率最高的恶性肿瘤[1]，据统计，2022年中国新发及死亡肺癌病例分别约65.87万例和73.33万例[2]。早诊早治是改善患者预后的关键，数据显示，早期肺癌（Ⅰ期）患者的5年生存率可达74%～95%，相较于晚期患者（18%）明显提升[3]。低剂量螺旋CT是临床筛查、诊断早期肺癌最为直接、简便且有效的手段，但存在辐射暴露、假阳性率高及长期随访成本不可控等局限性[4-5]，探索能与螺旋CT形成互补、适用于大规模人群的辅助筛查方法，具有重要的临床与现实意义。

与以循环肿瘤DNA（ctDNA）代表的液体活检技术相比，代谢组学检测所需的血浆量通常＜100 μL[6]，检测流程更为便捷[7]，且在肺癌的诊断中表现出与影像学相当的敏感性[8-9]，有望作为现有分子标志物筛查体系的潜在补充手段[10-11]。脂质组学是代谢组学的重要分支，可系统捕捉肿瘤脂质代谢重编程特征。基于非靶向策略的脂质组学因其覆盖范围广，已被广泛用于肿瘤候选标志物的筛选[12-13]。

老年人群（年龄≥60岁）是肺癌的高发群体，同时老年人的脂质代谢特征可因衰老相关的线粒体功能改变而呈现出与年轻群体不同的特征[14]，提示针对该人群进行脂质标志物研究具有特殊意义。此外，部分老年患者因合并基础疾病或对有创检查耐受性差，对便捷、无创的辅助筛查手段具有更迫切的需求。目前，针对老年人群肺癌脂质代谢标志物的研究尚不充分，且较少结合机器学习方法对模型在不同临床场景下的性能进行系统评估。本研究采用非靶向脂质组学结合机器学习方法，系统筛选老年早期肺癌患者血浆中的潜在诊断标志物，以期为构建基于微量样本、具备高灵敏度的肺癌早期筛查策略提供新的科学依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究为回顾性诊断准确性研究，共包含2个部分。其中，第一部分为分子标志物筛选。纳入2023年11月—2024年11月北京大学人民医院接受手术治疗且确诊的老年早期肺癌患者（早期肺癌组）、良性肺结节患者（良性肺结节组）及同期健康体检者（健康对照组）为研究对象。

早期肺癌组纳入标准：

（1）经病理学确诊为非小细胞肺癌或小细胞肺癌；（2）年龄≥60岁；（3）TNM分期Ⅰ期。

排除标准：

（1）既往曾接受过化疗、放疗、靶向治疗等治疗；（2）合并其他瘤种。

良性肺结节组纳入标准：

（1）年龄≥60岁；（2）经胸部CT发现有肺结节；（3）经病理学确诊为良性病变（如错构瘤、炎性结节、纤维增生等）。

排除标准：

有其他疑似肿瘤的证据。

健康体检者纳入标准：

（1）年龄≥60岁；（2）胸部螺旋CT检查未见异常。

排除标准：

有其他疑似肿瘤的证据。

此外，纳入本课题组前期开展的肺癌血浆脂质组学多阶段研究[9]中符合本研究纳入标准的早期肺癌患者和健康对照人群为独立验证集。其样本采集、储存和脂质组学检测均独立于上述队列。

第二部分为分子标志物功能验证。以人肺腺癌细胞系A549（购自北京大学细胞库）为研究对象，旨在探究筛选的分子标志物对肺癌细胞生物学功能的影响。由于在50次重复验证中，棕榈酸肉碱（CAR 16:0）的选择频率达100%，故以其为分子标志物代表进行功能验证。

本研究已通过北京大学人民医院伦理审查委员会批准（批号：2023PHB085-001），并豁免患者知情同意；独立验证队列已获原研究伦理批准（批号：2018PHB233-01），所有受试者均签署生物样本及临床数据使用通用知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集与脂质组学检测

收集受试者基本临床资料（如年龄、性别、吸烟史、病理类型、TNM分期），并采集空腹静脉血5 mL，室温静置30 min后，于4 ℃、3000×g离心15 min，分离血浆，置于-80 ℃冻存备用。采用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）技术进行非靶向脂质组学检测。

色谱条件：

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱温45 ℃，流速0.3 mL/min。流动相A为乙腈/水（60:40，v/v），含10 mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸；流动相B为异丙醇/乙腈（90:10，v/v），含10 mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸。

质谱条件：

电喷雾离子源，正、负离子模式同时采集。毛细管电压3.0 kV，锥孔电压40 V，离子源温度120 ℃，脱溶剂温度500 ℃。

1.2.2 数据处理与质量控制

原始数据经峰识别、峰匹配及保留时间校正后，采用内标归一化法进行校正。质量控制样本由所有待测样本等量混合制备。

1.2.3 多变量统计分析

采用主成分分析（PCA）评估样本的整体分布及质量控制样本的聚集程度，以评价数据质量。采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）进行有监督的模式识别，用于揭示两组间的代谢差异。通过200次置换检验对OPLS-DA模型的有效性进行验证。

1.2.4 机器学习特征选择

本研究设定了3种分类任务：

（1）早期肺癌组与全部对照组（良性肺结节组＋健康对照组）；

（2）早期肺癌组与良性肺结节组；

（3）早期肺癌组与健康对照组。

3种任务均采用相同的分子标志物及L1正则化支持向量机（L1-SVM）模型。为控制高维小样本数据中的过拟合风险，研究采用了多层策略：首先通过OPLS-DA进行特征预筛选，继而采用L1正则化进行稀疏特征选择，并结合增量特征选择(IFS)算法确定最优特征子集。模型性能的评估采用5折×5折嵌套交叉验证法，严格分离特征选择与评估过程，并进一步通过独立外部验证集进行验证。此外，为评估吸烟这一混杂因素的潜在影响，分别开展了纳入吸烟作为协变量的敏感性分析，以及基于从未吸烟亚组的敏感性分析。

1.2.5 模型验证

通过50次重复随机划分验证，评估模型的稳定性与泛化能力。每次随机将数据集按3:1的比例划分为训练集与测试集，并确保各组别比例在划分前后保持一致。记录每次验证的准确率、灵敏度、特异度及曲线下面积（AUC），并采用Bootstrap法（1000次重抽样）计算各指标的均值及其95%置信区间(CI)。统计每个特征在最优模型中被选入的频率，以评价特征选择的稳定性。模型的校准性能通过校准曲线及Brier评分进行评估，临床实用性则采用决策曲线分析（DCA）进行评价。

1.2.6 细胞分组

人肺腺癌细胞系A549采用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养。

1.2.7 CCK-8细胞活力检测

将A549细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板，培养24 h后分别加入不同浓度（0、10、20、40、50、60、80、100 μmol/L）的棕榈酸肉碱处理24 h。每孔加入10 μL 细胞计数试剂CCK-8，于37 ℃孵育2 h。采用酶标仪测定450 nm处吸光度值，并据此计算细胞存活率及半数抑制浓度（IC50）。

1.2.8 细胞划痕试验

将A549细胞接种于6孔板，待细胞融合度达95%以上时，用200 μL枪头垂直划痕。经PBS洗涤后，加入含不同浓度棕榈酸肉碱（0、20 μmol/L）的无血清培养基。分别于0、24、48、72 h在相同位置拍照，采用ImageJ软件测量划痕面积，并计算愈合率。愈合率（%）=（0 h划痕面积-X h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

1.3 统计学处理

采用MATLAB R2025a和R 4.3.0软件进行统计学分析。对于符合正态分布的计量数据，以均数±标准差表示，三组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，两组比较采用t 检验；不符合正态分布的计量数据以中位数（四分位数）表示，组间比较Mann-Whitney U 检验。计数资料以频数（百分数）表示，组间比较采用卡方检验。采用Spearman相关法进行相关性分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料

最终纳入早期肺癌组36例、良性肺结节组35例、健康对照组41名、独立验证集110人（早期肺癌患者59例、健康对照人群51名）。早期肺癌组中，病理类型为浸润性腺癌24例(66.7%)、微浸润腺癌8例(22.2%)、其他4例(11.1%)；TNM分期IA1期12例(33.3%)、IA2期6例(16.7%)、IA3期7例(19.4%)、IB期11例(30.6%)。早期肺癌组、良性肺结节组、健康对照组吸烟比例差异具有统计学意义（P=0.045），年龄、性别比例差异无统计学意义（P均＞0.05），见表1。

表1

受试者一般临床资料

2.2 脂质组学整体分析

采用HPLC-MS技术对112名受试者（早期肺癌组36例、良性肺结节组35例、健康对照组41名）的血浆样本进行脂质组学特征表征与非靶向脂质组学分析，结果共检测到3745个脂质。剔除缺失值超过50%的脂质后，剩余3645个脂质用于后续分析。PCA结果显示，质量控制样本紧密聚集于所有样本的中心位置，表明仪器稳定性良好，数据质量可靠（图1A）。

图1

代谢组学分析的多变量统计结果

A.PCA得分图(蓝色点为研究样本，绿色点为质量控制样本，质量控制样本紧密聚集表明数据质量良好)

PCA：主成分分析；OPLS-DA：正交偏最小二乘判别分析

OPLS-DA结果显示，早期肺癌组与对照组（良性肺结节组+健康对照组）存在明显的代谢差异（图1B），模型参数R22X=0.406，R2Y=0.529，Q2Y=0.44，表明模型具有良好的解释能力和预测能力。

B.OPLS-DA分析得分图

PCA：主成分分析；OPLS-DA：正交偏最小二乘判别分析

200次置换检验结果显示pR2Y=0.001，pQ2=0.001，进一步证实模型未发生过拟合现象（图1C、1D）。

C.OPLS-DA分析置换检验图；D.OPLS-DA分析样本诊断图

PCA：主成分分析；OPLS-DA：正交偏最小二乘判别分析

2.3 早期肺癌诊断分子标志物筛选

由于每种代谢物在区分早期肺癌与健康对照组中的作用各异，完整的特征（全部脂质特征）可能包含部分对早期肺癌检测贡献较小的代谢物“噪声”。为筛选出对两组准确区分贡献最大的特征子集，本研究基于OPLS-DA中的变量投影重要性（VIP）值，选取VIP＞1的代谢物进行特征选择。采用10次重复的5折嵌套交叉验证（共50次独立评估）进行特征筛选与模型验证。L1-SVM的正则化参数C通过内层交叉验证在{0.1, 0.5, 1, 2, 5}范围内自动优化，并采用加权策略处理类别不平衡问题。IFS曲线显示，当使用贡献度居前5个特征时分类准确率达峰值（75.79%）；随着特征数目进一步增加，准确率反而下降，最终降至约32%（接近随机猜测水平），表明特征过多可能导致严重过拟合现象（图2A）。

图2

特征选择与诊断模型评估

A.IFS曲线（红色星号标记贡献度居前5位特征的峰值点

IFS：增量特征选择

受试者工作特征（ROC）曲线显示，在筛查场景下（早期肺癌组比良性肺结节组+健康对照组），由5种肉碱标志物组合模型（最终模型）诊断早期肺癌的AUC为0.895（95% CI：0.700～1.000），灵敏度为98.4%，特异度为63.9%，准确率为75.0%。与基于全部413种脂质特征的模型相比，最终模型具有明显优势：全特征模型在训练集和测试集上的特异度均为0（将所有样本预测为阳性），表现出严重的过拟合；而5种标志物组成模型在训练集和测试集上的性能高度接近（训练集中AUC为0.891，测试集中AUC为0.885），具有良好的泛化能力（图2B、2C）。

图2

特征选择与诊断模型评估

B.含413个特征的模型出现过拟合；“SPE”为特异度，“ SEN”为灵敏度，“ ACC”为准确率；C.最终筛选的含5种肉碱标志物的模型

IFS：增量特征选择

2.4诊断模型性能评估

在独立验证集中，在筛查场景下（早期肺癌组比良性肺结节组+健康对照组）,最终模型诊断早期肺癌的AUC为0.874（95% CI：0.781～0.940），灵敏度为86.4%，特异度为82.4%，准确率为84.5%（图3A），与上述队列中的AUC相当，表明模型具有稳定的诊断效能。

图3

诊断模型性能的验证与评估

A.独立验证集中模型诊断早期肺癌的ROC曲线

ROC：受试者工作特征

为进一步评估模型在不同临床场景中的诊断能力，分别在早期肺癌组与良性肺结节组、早期肺癌组与健康对照组中进行了独立分析。结果显示，模型鉴别诊断早期肺癌与良性肺结节的AUC为0.877（95% CI：0.797～0.965）,灵敏度为86.1%,特异度为80.0%；鉴别诊断早期肺癌与健康对照人群的AUC为0.929（95% CI：0.877～0.988），灵敏度为94.4%，特异度为85.4%（图3B）。

图3

诊断模型性能的验证与评估

B. 5种肉碱标志物在不同分类场景中的ROC曲线

ROC：受试者工作特征

上述结果表明，由5种肉碱标志物组成模型在最具临床挑战性的良恶性结节鉴别场景中仍具有较好的诊断效能，而在早期肺癌筛查场景中表现更优。

考虑到3组间吸烟比例有统计学差异（P=0.045），故针对吸烟情况进行敏感性分析。结果显示，加入吸烟这一协变量后，模型在筛查场景下（早期肺癌组比良性肺结节组+健康对照组）诊断早期肺癌的AUC为0.894（95% CI：0.841～0.965），灵敏度97.2%，特异度78.9%；排除吸烟者后的亚组分析显示AUC为0.892（95% CI：0.827～0.969），灵敏度90.3%，特异度84.3%，5种标志物的效应方向与全人群一致，表明模型捕获的主要是肿瘤特异性信号。对模型的校准度进行评估，结果显示Brier评分为0.186，校准曲线整体沿理想对角线分布，提示模型校准度良好（图3C）。

图3

诊断模型性能的验证与评估

C.校准曲线图

ROC：受试者工作特征

DCA显示，在阈值概率17%～78%范围内，模型的净获益优于全部干预和全部不干预这两种默认策略，整体而言早期肺癌患者可从中获益（图3D）。

图3

诊断模型性能的验证与评估

D.决策曲线分析图

ROC：受试者工作特征

2.5 标志物差异表达及相关性分析

由于肉碱类标志物不符合正态分布，进一步采用Mann-Whitney U 检验对比了5种肉碱类标志物在早期肺癌组与对照组（良性肺结节组+健康对照组）中的表达差异。结果显示，棕榈油酸肉碱、棕榈酸肉碱、α-亚麻酸肉碱、亚油酸肉碱及油酸肉碱在早期肺癌组中的相对平均含量均显著低于对照组（P均＜0.001）（图4A）。

图4

5种肉碱标志物在早期肺癌组与对照组中的表达水平比较及相关性分析热图

A.差异性比较（蓝色为对照组，红色为早期肺癌组）

上述结果表明，肉碱代谢异常可能与肺癌的发生发展密切相关。通过Spearman相关性分析对筛选的标志物进行评估（图4B），结果显示5种肉碱类标志物之间存在较强的正相关性（r=0.65～0.90，P均＜0.001）。

B.Spearman相关系数热图，颜色越深表示相关性越强

其中，α-亚麻酸肉碱与亚油酸肉碱的相关性系数高达0.90，进一步说明这些化合物在生物学功能上具有高度一致性，可作为一组稳定的标志物群共同用于早期肺癌的辅助诊断。此种聚类特征进一步增强了前述差异分析结果的可靠性。

2.6棕榈酸肉碱对A549细胞活力和迁移的影响

基于上述脂质组学与机器学习筛选结果，在5种肉碱标志物中，棕榈酸肉碱在50次重复验证中的选择频率为100%，且已有文献报道其与肿瘤细胞代谢重编程相关[15]。本研究进一步对棕榈酸肉碱开展相关功能实验。CCK-8实验结果显示，棕榈酸肉碱对A549细胞具有剂量依赖性抑制作用，其IC50为57.12 μmol/L（图5A）。

图5

棕榈酸肉碱对A549细胞活力及迁移能力抑制作用

A.CCK-8实验结果显示IC50为57.12 μmol/L

IC50：半数抑制浓度

划痕试验结果显示，与对照组相比，20 μmol/L棕榈酸肉碱处理组的划痕愈合速度明显减慢。处理48 h后，对照组划痕愈合率为（20.79±2.54）%，而20 μmol/L棕榈酸肉碱处理组为（2.97±1.60）%，差异具有统计学意义（P＜0.001）（图5B、5C）。上述结果表明，外源性补充棕榈酸肉碱可抑制肺癌细胞的迁移能力。

B.划痕试验结果显示，与对照组相比，20 μmol/L棕榈酸肉碱处理组细胞的划痕愈合速度明显减慢；C.划痕愈合率统计图

IC50：半数抑制浓度

3 讨论

本研究采用L1-SVM结合IFS方法，从3645个血浆脂质特征中筛选出5种肉碱类标志物用于早期肺癌诊断，取得了较好的诊断效能（各种场景下AUC均＞0.85）。该方法有望应对脂质组学数据高维小样本的挑战，筛选出的标志物具有高度稳定性。

肉碱是脂肪酸β-氧化的关键辅因子，酰基肉碱作为线粒体功能的生物标志物,日益受到关注[16]。本研究发现，5种中长链酰基肉碱在早期肺癌患者血浆中显著降低，这与肿瘤细胞的代谢重编程密切相关。根据Warburg效应，肿瘤细胞即使在有氧条件下也优先通过糖酵解获取能量[17]。然而，Warburg效应仅描述肿瘤细胞的糖酵解优势。

近年研究发现，肿瘤细胞同样高度依赖脂肪酸氧化（FAO）作为重要能量来源，特别是在能量需求高峰或代谢应激状态下[18]。肉碱通过肉碱棕榈酰转移酶系统介导长链脂肪酸进入线粒体参与β-氧化，是FAO的关键限速步骤。肿瘤细胞FAO上调会导致血浆游离酰基肉碱被大量摄取消耗，从而呈现血浆中其水平降低的现象。Melone等[19]研究发现，肉碱系统参与肿瘤代谢的可塑性，表现为肺癌细胞对脂肪酸的摄取和利用增加，从而导致血浆中酰基肉碱水平下下降。Wu等[20]采用靶向代谢组学方法发现，多种实体瘤患者血清中中长链酰基肉碱水平显著降低，提示酰基肉碱可作为肿瘤诊断的潜在生物标志物。Li等[21]建立了基于肉碱类代谢物的肺癌Nomogram诊断模型，进一步证实了肉碱在肺癌诊断中的应用价值。

本研究进一步验证了血浆酰基肉碱作为肺癌诊断标志物的潜力。从化学结构来看，此5种肉碱均为含16～18个碳的中长链酰基肉碱，其代谢主要依赖肉碱棕榈酰转移酶系统介导的线粒体转运[22]。肺癌细胞中肉碱棕榈酰转移酶表达或活性改变可能同时影响这些肉碱的血浆水平。此种高度相关性也解释了为何模型仅需5种标志物即可获得较好的早期肺癌诊断性能——其可能共同反映了肺癌脂肪酸代谢紊乱这一核心特征。

从模型性能角度来看，本研究构建的5种肉碱标志物诊断模型在多种临床场景下均展现出良好的诊断效能。在筛查场景中，模型AUC达0.895，灵敏度高达98.4%，符合筛查工具对高灵敏度的应用需求。在最具临床挑战性的肺结节鉴别诊断场景中，模型的AUC仍达0.877，灵敏度为86.1%，特异度为80.0%，提示该模型在肺结节良恶性鉴别方面具有良好的应用潜力。与单一标志物相比，多标志物联合模型可弥补其诊断效能不足的局限；与基于全部413个脂质特征的高维模型相比，由5种标志物组成的精简模型有效避免了过拟合风险，并展现出更强的临床转化前景。校准曲线与DCA结果进一步验证了模型的良好校准度及临床实用性。此外，吸烟敏感性分析结果（加入吸烟作为协变量后AUC=0.894，针对不吸烟者亚组分析时的AUC=0.892）表明，模型性能不依赖于吸烟这一混杂因素，提示所筛选的标志物能够反映肿瘤特异性的代谢信号。

为进一步验证肉碱标志物对肺癌细胞生物学功能的影响，本研究选取筛选频率最高的棕榈酸肉碱进行体外细胞实验。CCK-8实验及划痕试验结果表明，外源性补充棕榈酸肉碱可抑制A549细胞的增殖与迁移能力。这一发现与肺癌患者血浆中肉碱水平降低的临床观察结果相呼应，提示肉碱可能通过调节肿瘤细胞代谢发挥抑癌作用。上述功能验证实验为肉碱作为肺癌诊断标志物提供了生物学机制层面的支持。从临床应用角度而言，本研究建立的诊断模型具有较高的灵敏度（98.4%），这对于肺癌筛查尤为重要。根据最新版美国癌症学会指南，筛查工具应优先保证灵敏度，以最大限度地减少漏诊。尽管本模型的特异度（63.9%）相对较低，但在筛查场景中，高灵敏度有助于尽可能多地发现潜在的肺癌患者。因此，本模型的性能特点与筛查工具的需求高度契合。

本研究存在以下局限性：（1）样本量相对较小，有待通过更大规模的多中心研究开展肺癌/良性结节/健康对照的三分类分析，并进一步验证模型的稳健性；（2）外部验证队列仅包含早期肺癌患者（59例）与健康对照人群（51例），未纳入良性肺结节组，可能导致验证队列中的诊断性能被高估，无法充分评估模型在真实临床筛查后结节人群中的鉴别诊断能力；（3）横断面研究设计无法评估标志物的动态变化。未来研究将扩大样本量，纳入肺部良性疾病患者及不同分期的肺癌患者，开展前瞻性验证。

综上所述，本研究采用L1-SVM结合IFS方法，从血浆脂质组学数据中筛选出5种肉碱类标志物（棕榈油酸肉碱、棕榈酸肉碱、α-亚麻酸肉碱、亚油酸肉碱及油酸肉碱）。基于该标志物组合建立的模型对早期肺癌具有良好的诊断效能，且在独立验证集中表现良好，可作为早期肺癌筛查的潜在生物标志物。